越南又发现斑鳖:eDNA技术确认全球第四只斑鳖的存在!

　　来源：科学大院微信公众号


2017年5月，研究人员在越南Xuan Khanh Lake拍到的斑鳖（图片来源：http://www.turtlesurvival.org）

　　“越南又发现一只斑鳖！”

　　4月12日，全球最权威的龟鳖保育组织TSA（国际龟鳖生存联盟，Turtle Survival Alliance ）在官网上宣布了这一消息。美国华盛顿州立大学助理教授Caren Goldberg通过检测环境DNA（eDNA），确证了该斑鳖的存在。

　　很快，这一消息在朋友圈传播开来。

　　斑鳖有多么濒危？

　　“发现一只斑鳖有什么好激动的”？问出这个问题的人，一定不了解它的濒危程度。

　　斑鳖，这种浑身布满黄斑的椭圆形大鳖，背盘就能达到1米以上，体重能超过100公斤，是全世界三百多种龟鳖里数量最少、也是最濒危的龟鳖，没有之一。

　　加上4月12日刚在越南确定的一只，目前，全世界已知有4只活着的斑鳖：中国两只，在苏州动物园；越南两只，分别在Dong Mo Lake和这次发现地Xuan Khanh Lake（根据越南文中文对照表分别译为同莫湖和春庆湖，国内媒体音译为东莫湖和宣汉湖）。

　　从常见变成极危动物，只用了半个世纪

　　1873年，英国分类学家John Edward Gray研究了从上海附近采集的大鳖标本。因为这只标本是由Robert Swinhoe寄回到英国博物馆的，Gray就采用林奈发明物种命名的双名法将这个物种命名为Oscaria（属名）+ swinhoei（种本名）。当时，Gray认为这是他见过的最漂亮的鳖。

　　然而在接下来的一百多年里，限于当时研究条件的简陋和样本量的稀少，加之斑鳖幼体和中华鳖非常相似，成体和鼋又非常相似，斑鳖一直被误认为是鼋（Pelochelys cantorii）或者中华鳖（Pelodiscus sinensis）。


中华鳖Pelodiscus sinensis（图片源自维基百科）

　　这一期间，太湖流域的斑鳖还被命名为斑鼋（Yuen maculatus）或者太湖鼋（Pelochelys taihuensis）。直到1988年，Meylan和Webb重新恢复了斑鳖的有效性，并将斑鳖移入Rafetus属，拉丁名变更为Rafetus swinhoei。期间赵肯堂老先生为斑鳖正名四处奔走。国内学界直至1994年才由赵尔宓首次承认Rafetus swinhoei的有效性，并建议中文名称为“斑鳖”。

　　实际上在很早以前，中国人就认识了斑鳖，最为著名的传说就是“鼋鼍为梁”。传说周穆王三十七年时兴兵东进，到了九江，令江中的鼋鼍排列起来成为桥梁，于是渡江伐越。直到2005年，人们从赵肯堂的书中才恍然发现“古籍和资料中所指的鼋，今天看来应该都是斑鳖”。

　　遗憾的是，在科学家绞尽脑汁考证和确认斑鳖的过程中，人们从没有放慢破坏斑鳖生境和捕捉斑鳖的脚步。

　　上个世纪前半叶，人们还能在太湖和红河捕捉不少斑鳖，有些个体被送到各个动物园或放生到寺庙中。上世纪90年代，上海自然博物馆在集市上先后购得几只背面布满黄斑的活鳖。1998年红河还有捕获野生斑鳖的报道。

　　但之后20多年来，国内再也没有野生斑鳖的消息。

　　由于环境的限制，动物园或者寺庙的斑鳖陆续死亡。最终国内只剩下长沙动物园和苏州动物园分别有一雌一雄。国外这时候也只有越南还剑湖还有一只。

　　为了拯救斑鳖，2007年，长沙动物园和苏州动物园终于达成协议，让两只中国最后的斑鳖联姻。2008年5月5日联姻正式启动。

　　这一年，越南也传来好消息，同莫湖发现一只斑鳖。

　　但遗憾的是，中国的两只斑鳖10年来经历多次自然交配和人工授精均未成功。2016年，越南还剑湖的斑鳖突然死亡。

　　斑鳖离灭亡越来越近。

　　同时，科学家和保护人士也加快了脚步。一方面大家对中国的这对斑鳖仍然抱有希望，另一方面，也加大了红河流域的调查力度。在云南红河马堵山水库和越南的河内西部的春庆湖，陆续有些疑似斑鳖的线索，但没有确切的证据，专家们还不敢确认。

　　功夫不负有心人，2018年4月12日，越南传来了重大消息――确认春庆湖存在斑鳖！这一消息振奋了所有关心斑鳖、保护斑鳖的人！而这次的大新闻，也使一门新的技术――环境DNA（environmental DNA， eDNA）技术进入了公众的视野。eDNA仿佛一件神器，在茫茫的湖水中就这么确认了斑鳖存在的证据。

　　什么是eDNA？

　　那么，什么是eDNA，它为什么能在动物保育的领域中发挥这么重大的作用？

　　事实上，eDNA成为生态学家和保育工作者手中的工具，时间并不长。在过去的十多年里，DNA测序技术爆发式成长，DNA测序平台的能力增长了至少4个数量级，而价格越来越亲民，使得随时随地的测序已经成为一个现实。因此，eDNA的发展是一个水到渠成的结果。

　　eDNA的原始定义其实很简单：eDNA是指在环境样品中所有被发现的不同生物的基因组DNA的混合。

　　这里的环境样品是一个非常宽松的概念，可以包括土壤、沉积物、排泄物、空气、水体，甚至生物个体本身（如马氏网捕获的昆虫）。动物在某个环境中生活，身上的各种痕迹会携带者自身DNA掉落到四周。

　　作为一项技术，分析eDNA的目的就是获取这些环境样品中DNA所属物种的分类学信息和基因功能信息。再讲通俗一点，科学家提取环境样品中的eDNA，就是为了分析这些DNA分别是属于哪些物种，从而证实在相应环境中存在哪些物种。eDNA的目的，与传统的动植物分类调查其实是一致的。


野外eDNA提取代替传统的生物多样性调查（图片来源：https：//www.google.com.hk/）

　　eDNA有哪几种类型？

　　eDNA可以简单地依据其使用的目的分为两类。

　　第一类eDNA类似于对环境的生物多样性调查，方法是检测环境样品中尽可能多的DNA序列，与数据库比对分析它们所属的物种分类信息，最终鉴定在这个环境中生活的所有物种，这个方法又被称为DNA宏条形码（DNA metabarcoding）。在样品处理上，DNA宏条形码使用普通的聚合酶链式反应（PCR）或直接霰弹枪法（shotgun strategy）测序，这两个实验方法都比较成熟，能够方便获得多个DNA序列。

　　另一类eDNA技术类似于特定生物调查，目标是寻找在环境样本中是否有单一物种的DNA存在，通常用于研究和追踪珍稀物种在自然界的分布。它与第一类DNA宏条形码的区别在于它并不在意环境中属于其它物种的DNA，因此在样品处理上通常使用更精确的定量PCR（qPCR）技术，目标是找到极其少量的目标物种的DNA。


eDNA的工作流程（图片来源：参考文献5）

　　eDNA的发展历史

　　eDNA的发展最早可以到追溯到1987年，在一篇研究沉降物DNA提取技术的文献里最早提出了eDNA这个概念。

　　到1990年，出现了第一项使用这个技术的工作，研究人员使用eDNA分析了海水样品中的微生物DNA。不过在这之后eDNA都一直只局限在微生物的鉴定之上，直到2003年eDNA第一次被用于检测环境样品中的大生物（macroorganism，与微生物相对，指肉眼看得到的生物）的DNA并获得成功。之后高通量测序技术的发展助推了eDNA的发展，2008年eDNA第一次用于检测淡水样品中的物种，2010年第一次在粪便样品中检测动物的食物分类……

　　直到今天，eDNA成为了生态学家和保育工作者手中的重要工具，从历年发表的eDNA文献数量中，我们也可以看出这个爆发的趋势。




eDNA的发展历史（图片来源：参考文献5）

　　eDNA这么神奇，是万能的吗？并不

　　eDNA面临的最大挑战就是环境样品的复杂性，不仅包含各种生物的DNA分子，还包括一些已降解或被破坏的胞外DNA，以及各式各样奇怪的物质，因此并没有一种标准化的方法可以进行统一的样本处理。

　　实验能否成功很大程度上取决于样品本身，换一个委婉的说法，就是运气。

　　大多数的DNA宏条形码应用都需要使用PCR来扩增目标DNA的产量，这又为eDNA引入了一个风险，这个风险就是来自引物。最佳的引物需要有两端极度保守的侧翼序列以及中间一段多样性的片段，保守序列用于引导PCR，而多样性片段则用于确定物种的信息。然而通常情况下，要寻找一段符合要求的对所有目标物种都管用的引物非常困难，稍微一点偏差可能就会造成结果的偏移。当然了，霰弹枪法可以略过这一环节，不过样本的不稳定性也有可能使得霰弹全部落空。

　　而对于只搜寻一个物种的eDNA，qPCR技术能够在痕量的DNA中找到想要的那一个。不过qPCR也有一个很大的缺点，就是对于杂质的干扰更敏感。因此，要验证一个物种是否真的存在，一定要在同一个环境的不同时空样本中都检测到信号，才能给我们一个稍微肯定的结果！


用于识别物种的DNA宏条形码结构（图片来源：参考文献5）

　　而来自越南春庆湖的样品，eDNA检测给出了清晰的正向结果，表明春庆湖确实存在斑鳖！

　　国内的科学家们希望，利用环境DNA技术，能在云南红河流域尽快找到更多的野生斑鳖，让它们加入斑鳖的保育计划，尽快地繁殖出后代。

　　斑鳖已经错过了1988年颁布的《国家重点保护野生动物名录》。而这三十年里，这份名录几乎没有变动。直至今日，斑鳖还没有受到法律的保护，作为科研人员，我们热切希望《国家重点保护野生动物名录》尽快更新，同时，也希望云南红河不要再建大坝，不要再硬化河道，保护斑鳖的原生环境。

　　斑鳖保育，必须和时间赛跑！

　　<em>参考文献：</em>

　　<em>1。 Ogram A， Sayler GS， Barkay T （1987）。 The extraction and purification of microbial DNA from sediments。 Journal of Microbiological Methods， 7， 57?66。</em>

　　<em>2。 Giovannoni SJ， Britschgi TB， Moyer CL， Field KG （1990）。 Genetic diversity in Sargasso Sea bacterioplankton。 Nature， 345， 60?63。</em>

　　<em>3。 Willerslev E， Hansen AJ， Binladen J， et al。 （2003）。 Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments。 Science， 300， 791?795。</em>

　　<em>4。 Smith O， Momber G， Bates R， et al。 （2015）。 Sedimentary DNA from a submerged site reveals wheat in the British Isles 8000 years ago。 Science， 347， 998?1001。</em>

　　<em>5。 Taberlet P， Bonin A， Zinger L， et al。 （2018）。 Environmental DNA： For Biodiversity Research and Monitoring。 Oxford press。</em>

　　<em>6。 吕顺清，徐健（2009）。斑鳖。森林与人类， （08）：76-85。</em>

　　<em>7。 王剑，史海涛，韩联宪（2010）。 Rafetus swinhoei名称的历史考证与中文名更改为“黄斑巨鳖”的建议。 生物学通报， （07）： 11-12。</em>